Neue CRISPR-Plattform erweitert RNA-editing-Funktionen: Das neue system, genannt RESCUE, können RNA-änderungen vorgenommen werden, die bisher nicht möglich waren

Neue CRISPR-Plattform erweitert RNA-editing-Funktionen: Das neue system, genannt RESCUE, können RNA-änderungen vorgenommen werden, die bisher nicht möglich waren

CRISPR-basierte tools revolutioniert unsere Fähigkeit, Ziel-Erkrankung verknüpften genetischen Mutationen. CRISPR-Technologie umfasst eine wachsende Familie von Werkzeugen, dass Sie beeinflussen können Gene und deren expression, einschließlich durch targeting-DNA mit den Enzymen Cas9 und Cas12-und targeting-RNA mit dem Enzym Cas13. Diese Sammlung bietet verschiedene Strategien für die Bekämpfung von Mutationen. Targeting-Krankheit-verbunden mit Mutationen in der RNA, die relativ kurzlebig sind, würde verhindern, dass bleibende Veränderungen des Genoms. Darüber hinaus sind einige Zelltypen, wie Neuronen, sind schwierig zu Bearbeiten, unter Verwendung CRISPR/Cas9-mediated Bearbeiten und neue Strategien sind erforderlich, um die Behandlung von verheerenden Krankheiten, die das Gehirn betreffen.

McGovern Institute Investigator und Broad Institute des MIT und Harvard core member Feng Zhang und sein team haben jetzt entwickelt eine solche Strategie, genannt RESCUE (RNA-Editing für die Spezifische C zu U Exchange), beschrieben in der Zeitschrift Science.

Zhang und sein team, einschließlich der ersten co-Autoren Omar Abudayyeh und Jonathan Gootenberg (beide jetzt McGovern fellows), verwenden, deaktiviert Cas13 zu führen RESCUE gezielte Cytosin-Basen, RNA-Transkripten und eine neuartige, entwickelt, programmierbare Enzym zu konvertieren unerwünschte Cytosin, uridin in — und dabei Regie führen, eine Veränderung in der RNA-Anweisungen. RESCUE baut auf die REPARATUR, eine Technologie, entwickelt von Zhang ‚ s team, dass änderungen der Basen Adenin zu Inosin in RNA.

RETTUNG wird wesentlich erweitert, die Landschaft, die CRISPR-tools kann den Gegner einschließen modifizierbaren Positionen in Proteinen, wie Phosphorylierung Websites. Solche Seiten dienen als ein – /aus-Schalter für die protein-Aktivität und vor allem gefunden in signalmolekülen und Krebs-verbunden Wege.

„Zur Behandlung der Vielfalt von genetischen Veränderungen, die die Krankheit verursachen, müssen wir ein array von präzise Technologien, zum von zu wählen. Durch die Entwicklung dieser neuen Enzym und die Kombination mit der Programmierbarkeit und Präzision von CRISPR, konnten wir füllen eine kritische Lücke in der toolbox,“ sagt Zhang, der James und Patricia Poitras Professor für Neurowissenschaften am MIT. Zhang hat Termine MIT den Abteilungen des Gehirns und der Kognitionswissenschaften und Biologischen Verfahrenstechnik.

Erweiterung der Reichweite von RNA-editing auf neue Ziele

Die bisher entwickelten REPARATUR-Plattform verwendet, die RNA-targeting CRISPR/Cas13 direkt die aktive Domäne eines RNA-editor, ADAR2, um die spezifischen RNA-Transkripten, wo könnte es zu konvertieren, dass die Nukleotid-base Adenin zu Inosin, oder Buchstaben von A bis I. Zhang und Kollegen nahmen die REPARATUR-fusion und entwickelt es im Labor, bis es ändern könnte Cytosin zu uridin-oder C-U.

RETTUNG geführt werden können zu jeder RNA der Wahl, führen Sie dann eine C-zu-U Bearbeiten, durch die sich entwickelte, ADAR2-Komponente der Plattform. Das team nahm die neue Plattform in menschliche Zellen ein, die zeigen, dass Sie Ziel natürlichen RNAs in der Zelle, als auch die 24 klinisch relevanten Mutationen in der synthetischen RNAs. Sie dann weiter optimiert RETTUNG zu reduzieren, verfehlt Bearbeiten, während minimal stören die on-target Bearbeiten.

Neue Ziele in Sicht

Erweiterte targeting durch RETTUNG bedeutet, dass die Seiten der Regulierung der Aktivität und Funktion vieler Proteine durch posttranslationale Modifikationen, wie Phosphorylierung, Glykosylierung, und Methylierung, können jetzt leichter für die gezielte Bearbeitung.

Ein großer Vorteil der RNA-editing ist seine Reversibilität, im Gegensatz zu änderungen auf der DNA-Ebene, die dauerhaft sind. So, RETTUNG eingesetzt werden könnte, vorübergehend in Situationen, wo eine änderung wünschenswert sein mag vorübergehend, aber nicht dauerhaft. Um dies zu demonstrieren, zeigte das team, dass in den menschlichen Zellen RETTEN können, bestimmte Websites in die RNA-Codierung β-catenin, bekannt sind phosphoryliert, die auf dem protein-Produkt, was zu einem vorübergehenden Anstieg in β-catenin-Aktivierung und das Wachstum von Zellen. Wenn eine solche änderung dauerhaft gemacht, könnte es bereiten Zellen zu unkontrolliertem Zellwachstum und Krebs, aber durch die Verwendung von RETTUNGS -, Transienten Wachstum der Zellen könnte möglicherweise stimulieren die Wundheilung in Reaktion auf akuten Verletzungen.

Die Forscher auch gezielt einem pathogenen gen-Variante APOE4. Das APOE4-Allel konsequent hat sich als ein genetischer Risikofaktor für die Entwicklung late-onset Alzheimer-Krankheit. Isoform APOE4 unterscheidet sich von APOE2, die nicht nur ein Risiko-Faktor, der von nur zwei Unterschiede (sowohl C als in APOE4 gegenüber U in APOE2). Zhang und Kollegen eingeführt, die das Risiko-verbunden APOE4-RNA in Zellen und zeigte, dass die RETTUNG konvertieren kann seine Unterschrift Cs zu einem APOE2-Sequenz, die im wesentlichen die Umwandlung einer Risiko-zu einer nicht-Risiko-Variante.

Zur Erleichterung der zusätzlichen Arbeit, die schieben die RETTUNG in Richtung der Klinik, als auch ermöglichen, Forscher zu RETTEN, als ein Werkzeug, um besser zu verstehen, krankheitsverursachende Mutationen, die Zhang lab-Pläne teilen das RESCUE-system breit, als Sie mit den bisher entwickelten CRISPR-tools. Die Technologie frei verfügbar sein wird für die Akademische Forschung über den nonprofit-plasmid-repository Addgene.

Unterstützung für die Studie wurde von Der Phillips-Familie; J. und P. Poitras; der Poitras-Zentrum für Psychiatrische Erkrankungen-Forschung; Hock E. Tan und K. Lisa Yang-Mitte für Autismus-Forschung; Robert Metcalfe; David Cheng; und ein Natinoal Instituten der Gesundheit gewähren, Omar Abudayyeh. Feng Zhang, ein in New York Stem Cell Foundation-Robertson Ermittler. Feng Zhang wird unterstützt durch die Nationalen Institute der Gesundheit; das Howard Hughes Medical Institute; der New York Stem Cell Foundation, und der G. Harold und Leila Mathers Stiftungen.