Wissenschaftler finden Methode zur Steigerung CRISPR Effizienz: die Entdeckung gemacht während der Bearbeitung genetischer defekt hinter der Duchenne-Muskeldystrophie

Wissenschaftler finden Methode zur Steigerung CRISPR Effizienz: die Entdeckung gemacht während der Bearbeitung genetischer defekt hinter der Duchenne-Muskeldystrophie

Wissenschaftler haben eine Methode entwickelt, um steigern die Effizienz der CRISPR-gen Bearbeitung in Duchenne-Muskeldystrophie (DMD), laut einer Studie könnte auch Auswirkungen für die Optimierung des gen-Therapien für andere Krankheiten.

Der Befund ergab sich aus der Forschung am UT Southwestern, in denen eine single-cut gen-editing-Technik wurde an Mäusen und menschlichen Zellen zu korrigieren, eine gemeinsame mutation zugrunde liegt, dass die DMD, die eine tödliche Krankheit, verursacht durch Verlust von dystrophin, ein protein entscheidend für die Muskelfunktion.

Beim testen der Technik, entdeckten die Wissenschaftler, dass sich eine Anpassung der Dosierung von CRISPR – gene-editing-Komponenten deutlich verbessern können, wie viel dystrophin produziert von der bearbeiteten Gene. Sie fanden außerdem heraus, dass das optimale Verhältnis der Komponenten verändert, auf deren Grundlage ein Teil der DNA wurde bearbeitet.

„Wie wir testen CRISPR auf andere defekte Teile des dystrophin-Gens, kann es wichtig sein, zu optimieren unserer Formeln, um optimale Ergebnisse zu erzielen,“ sagte Dr. Eric Olson, wer führte die Studie, veröffentlicht in der Wissenschaft Fortschritte. „Diese neue Erkenntnis weiter erleichtert die Verwendung von CRISPR wie eine Therapie für Duchenne-und vielleicht eine Reihe von anderen Erkrankungen.“

Unerwartete Entdeckung

Die gen-editing-Technik, die verwendet von den Forschern erfordert zwei Komponenten-ein Enzym namens Cas9, das schneidet die DNA und einer guide-RNA, die funktioniert wie ein molekularer GPS-Gerät direkt Cas9 der spezifischen DNA-Sequenz in das Genom bearbeitet werden.

Dr. Olson Labor eine Methode entwickelt, um Bearbeiten Sie die fehlerhafte Teil des dystrophin-Gens durch das laden von Cas9 in einem adeno-assoziierten virus (AAV), ein harmloses virus, das verwendet wird, zu liefern, Bearbeiten von Komponenten in die Zellen. Die guide-RNA wird auch geladen in ein AAV direkten Cas9 der mutation, wo es Schnitte der DNA.

Die Bearbeitung umgeht die mutation und ermöglicht die Muskelfasern zu produzieren dystrophin, mit positiven Ergebnissen dokumentiert, die in früheren Studien von Dr. Olson in großen Säugetiere, Mäuse-und menschlichen Zellen.

In diesen Studien, das team verwendet eine standard 1-zu-1-Verhältnis von Cas9-und guide-RNA zur Wiederherstellung der dystrophin-Produktion im Muskel um mehr als 90 Prozent des normalen.

In der neuen Studie targeting einen anderen Teil des Gens, entdeckten Sie die 1-zu-1-Verhältnis nicht so gut funktionieren: der Dystrophin-Produktion war erst wieder um 5 Prozent normal-bei der Lieferung in die Blutbahn.

Durch Versuch und Irrtum fanden die Wissenschaftler mit einem 10-zu-1-Verhältnis der guide RNA zu Cas9 ermöglichte eine optimale Bearbeitung des jeweiligen Segments des dystrophin-Gens. Innerhalb von vier Wochen eine CRISPR Dosis, dystrophin-Produktion restauriert wurde, in über 90 Prozent der Muskel-und Herz-Fasern in Mäusen mit einem gemeinsamen DMD-mutation.

„Das ist überraschend“, sagte Dr. Yi-Li Min, die Studie der erste Autor. „Wir haben immer geliefert, die guide-RNA und Cas9 mit beiden Viren in den gleichen Mengen und gar nicht daran gedacht zu schauen, die Veränderung des Verhältnisses.“

Defekte exons

DMD, die häufigste tödliche genetische Erkrankung bei Jungen, führt zu Muskel-und Herzschwäche und VORZEITIGEM Tod durch den frühen 30er Jahren. Die Patienten sind gezwungen, in die Rollstühle, wie Ihre Muskeln degenerieren und schließlich auf die Atemschutzmasken wie Ihr Zwerchfell Muskeln schwächt. Keine effektive Behandlung existiert, obwohl Wissenschaftler seit Jahrzehnten wissen, dass ein defekt in einem der 79 exons, enthalten die lange dystrophin-gen verursacht die Erkrankung.

Dr. Olson veröffentlichte mehrere Studien, in denen seinem Labor aus einzelnen Schnitte an strategischen Punkten der DNA zu korrigieren Mutationen. Auch seine neueste Studie, die sich auf der deletion von exon 44, sein Labor erstellt hat CRISPR-Techniken, deren Ziel die fünf häufigsten Fehler gesehen im DMD-Patienten, die etwa die Hälfte der Fälle weltweit. Eine klinische Behandlung für exon-44, die sich in einem der am meisten common mutational hotspots auf dem gen, profitieren kann, etwa 12 Prozent der Patienten.

Die Techniken, die wurden noch nicht für den klinischen Einsatz zugelassen, aber Dr. Olson ‚ s team hat einen großen Schritt in Richtung auf dieses Ziel im vergangenen Jahr nach der Veröffentlichung einer Science-Studie, die zeigen, dass CRISPR-Bearbeitungen auf exon 51 gestoppt das Fortschreiten der Krankheit bei Hunden.

Innerhalb von ein paar Wochen von der gen-editing, das fehlende protein wurde restauriert Muskel-Gewebe-gesamten Körper, einschließlich der 92-Prozent-Korrektur im Herzen und 58 Prozent in das Zwerchfell, der wichtigste Muskel für die Atmung benötigt. Wissenschaftler haben geschätzt, ein 15-Prozent-Schwelle ist notwendig, um deutlich Patienten helfen.

Das Labor ist die Durchführung von längerfristigen Studien bei Hunden zu Messen, ob die dystrophin stabil bleiben und sicherzustellen, dass die gen-änderungen haben keine nachteiligen Nebenwirkungen.

Dr. Olson hofft, den nächsten Schritt über Hunde ist eine klinische Studie, die wäre unter mehreren, die UT Southwestern-gen-Therapie-Programm zielt darauf ab zu starten, in den kommenden Jahren zu Anschrift zahlreichen tödlichen Kinderkrankheiten.

„Wir haben mehr zu tun, bevor wir Sie nutzen können diese klinisch“, sagt Dr. Olson sagte, „aber es ist spannend zu sehen, wie weit wir kommen.“

Über die Studie

Dr. Franke ist Direktor des UT Southwestern ist Hamon Center für Regenerative Wissenschaft und Medizin, und Professor und Stuhl der Molekularen Biologie. Er hält das Pogue Distinguished Chair in Research an Kardialen Fehlbildungen, die Robert A. Welch Distinguished Chair in der Wissenschaft, und die Annie und Willie Nelson-Professur für Stammzellforschung. Er ist auch der Gründer von Exonics Therapeutics Inc., gestartet im Februar 2017 zu fördern und zu kommerzialisieren seiner Forschung.

Die Studie wurde unterstützt, zum Teil durch Exonics Therapeutics Inc. und Zuschüsse aus den National Institutes of Health, dem Senator Paul D. Wellstone-Muskeldystrophie Cooperative Research Center, Der Robert A. Welch Foundation, Parent Project Muscular Dystrophy, und CureDuchenne.

Disclosure statements: Dr. Eric Olson ist eine wissenschaftliche co-Gründer und Berater für, Exonics Therapeutika, und hat Lizenz-und investment-Interessen mit dem Unternehmen. Dres. Olson und Yi-Li Min-co-Erfinder auf einer Patentanmeldung in Bezug auf das Maus-Modell und Strategie die in dieser Studie vorgestellt. Dr. Min arbeitete in Dr. Olson lab während der Forschung wurde durchgeführt, und ist jetzt ein Mitarbeiter von Exonics.